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今天分享一篇2020年7月份的文章，发表在Cli Cancer Res, IF:12.532. 该文章通过多组学、多平台数据分析，阐述复杂的免疫表型调节网络。非常值得我们学习和思考，今天我们一起学习这篇文章：多组学数据综合分析识别头颈癌免疫表型相关的调控网络中关键节点：EGFR、PTGS2。
Integrative Analysis of Multi-omics Data Identified EGFR and PTGS2 as Key Nodes in a Gene Regulatory Network Related to Immune Phenotypes in Head and Neck Cancer
一、摘要
Purpose: 肿瘤恶性进展显示了免疫效应和免疫耐受之间紧密协调的平衡。然而，驱动肿瘤免疫表型建立和维持的潜在分子原理仍有待阐明。
Experimental Design: 该研究基于与程序性死亡配体 (PD-L1)和干扰素γ (IFNγ)表达相关的免疫细胞亚群训练了一种新的分子分类器，该分类器显示了不同的亚群，具有较高的细胞毒性免疫表型(A类)或较低的细胞毒性免疫表型(B3类)。 采用多组学数据进行综合分析，以确定遗传和表观遗传格局的差异，以及它们对免疫表型差异表达基因(DEG)的影响。采用LASSO 回归建立免疫检查点抑制(ICI)的预后基因模型。
Conclusions: 研究表明基因组和表观遗传事件之间的复杂的相互作用的建立肿瘤免疫表型的重要作用，并对ICI治疗失败的风险更高头颈鳞癌患者可能受益于联合EGFR抑制的应用提供有力的证据。
二、流程图
三、结果简述
1. HNSCC样本中与PD-L1、IFN–γ表达相关的分子免疫亚型
本研究基于5个独立基因表达队列（训练集：TCGA-HNSC (n =500)、验证集：GSE117973、GSE39368、GSE40774 、GSE65858），共包含1106个样本，使用CIBERSORT（LM22）评估单个样本中不同免疫细胞比例（22种免疫细胞）。采用Spearman相关性计算PD-L1(CD274)、IFN-γ表达和免疫细胞评分之间的相关性（图A）。
LASSO回归模型显示了6种常见的免疫细胞亚型，其中5种(CD8 T细胞、活化CD4记忆T细胞、活化NK细胞、M1巨噬细胞和M2巨噬细胞)被选择进行进一步分析。静息NK细胞由于在验证队列中评分低而被排除在外(>50%的样本没有评分)。研究还通过Meta分析证实上述5类免疫细胞类型的比例升高与各HNSCC队列中PD-L1、IFN-γ高表达显著相关。
2. 基于免疫细胞类型行层次聚类实现亚型分层
该研究基于5个免疫细胞类型对TCGA-HNSC队列进行无监督层次聚类，主要划分成A、B两类(图B)。A亚型显示出较高的免疫细胞浸润比例，且PD-L1、IFN-γ表达水平及PD-L1蛋白水平较高（图C）。
由于活化NK细胞的绝对评分差异显著，A亚型被分为A1和A2两个亚组。B亚型的特定免疫细胞亚群评分较低且异质性更强，B1则展现出活化CD4-T细胞和MI巨噬细胞中等浸润及较高的PD-L1、IFN-γ表达水平，B3亚群中表现PD-L1和IFN-γ转录水平较低（图B）。此研究将A亚型定义为高细胞毒性免疫表型，B3亚型为低细胞毒性免疫表型。在TCGA-HNSC队列以及所有独立验证队列中，扩增免疫基因标记的ssGSEA富集评分在A亚型中显著较高，而在B3亚型中最低（图D）。在临床结局方面，A亚型患者的生存期较B3亚型患者有所改善，两组患者的5年总生存期差异有统计学意义。此外，该研究还进行多种癌症的分析验证，无监督聚类分析发现了同样的聚类模式。
3.MHC I类分子相关基因在不同免疫表型中的表达差异
通过MHC I类复合物呈递肿瘤相关抗原是免疫监视的先决条件，是针对免疫检查点的免疫治疗的临床反应的重要分子。该研究评估了TCGA -HNSC和独立验证队列免疫表型中编码MHC I类蛋白的分子，B2M和HLA基因的转录水平。结果可见A1到B3的相关表达逐渐下降，抗原呈递能力下降，一定程度解释B3亚型的不良预后（图A）。
4. 不同免疫表型之间的体细胞突变差异
基于TCGA-HNSC队列分析了各免疫表型的体细胞突变。尽管总的突变负荷在整体上没有显著的差异（图A）。
对于CASP8突变频率，A亚型比B3亚型更高，其中A1亚型最为显著。在A1-B3亚型中EP300突变频率逐渐降低，相反的是TP53突变逐渐升高（图B）。
与HNSCC相似，四个TCGA队列(BLCA、CESC、STAD和COAD)在A1亚群中CASP8突变的相对频率较高，而四个TCGA队列(BLCA、CESC、STAD和THYM)在A1亚群至B3中EP300突变的相对频率逐渐下降(如下图)。
5. 不同免疫表型之间的基因组拷贝数差异
Davoli及其同事证明体细胞拷贝数改变(SCNA)与免疫逃避有关(39)，表明基因组改变对肿瘤免疫表型有强烈的影响。TCGA-HNSC队列基因组改变分析表明，在几个热点区域与亚型A相比亚型B3在（染色体7p，11q，13q和18p）显著扩增或在（染色体3p，5q，9p和18q）显著缺失（图B）。为了评估这些拷贝数变异是否影响受影响基因的转录，该研究分析了TCGA-HNSC队列中的A亚型和B3亚型中的DEGs。发现1609个基因在亚型A中上调，707个在B3中上调（图C）。在A亚型中，143个上调的DEG是由在B3B3亚型中缺失频率显著较高的基因组区域编码的，而在该B3亚型中，21个上调的DEG是由在B3亚型中扩增频率显著较高的基因组区域编码的（图B）。
同HNSCC相似的是，B3亚型与A亚型相比，LUSC，LUAD和STAD等队列共享显著的染色体富集(3p, 5q)或缺失(9p)，以及7p染色体拷贝数增加（如下图）。
6. 不同免疫表型之间的DNA甲基化差异
该研究为了探索DNA甲基化对肿瘤免疫表型形成和维持的影响，分析了TCGA-HNSC队列的总体甲基化数据。筛选了A亚型和B3亚型间2796种差异甲基化探针（-0.35> log2 FC> 0.35，FDR <0.001）；在B3亚型中beta值显著较高的267个探针位于152个在A亚型中表达较高的DEGs的近端启动子上（图E），在A亚型中beta值显著较高的130个探针位于69个在B3亚型表达较高的DEGs的近端启动子上（图E）。
7. 不同免疫表型之间的miRNA和lncRNA表达差异
基于TCGA-HNSC队列，筛选免疫A亚型和B3亚型之间的差异表达功能miRN（图A），筛选标准：(DEFM; 1>log2FC>1, FDR < 0.05)。B3亚型高表达的miRNA 关联的535个DEFM-DEG关系对中347个DEGs在A亚型中上调。A亚型高表达的miRNA 关联的183个DEFM-DEG关系对中133个DEGs在B3亚型中上调（图B）。对于lncRNA而言，该研究做了相似的工作，基于TCGA-HNSC队列，筛选免疫亚型A和B3之间的差异表达lncRNA（图C），筛选标准：(-1>log2FC>1, FDR < 0.05)。根据数据库预测到了3276个lncRNA-miR关系对，包括74个lncRNA和208个miRNA。其中在A亚型中1081个关系对中关联的423个DEGs上调，B3亚型中390个关系对中关联的168个DEGs上调（图D）。
基于差异表达的lncrna、预测的miRNA链接以及靶向基因，该研究确定了一个复杂的网络，总结了不同肿瘤免疫表型的潜在分子特征（图E）。
8. DEGs受多种遗传和表观遗传调控模式的影响
该研究认为受不同遗传和表观遗传调控模式影响的DEGs可能是建立和/或维持肿瘤免疫表型的关键驱动因素。在上述分析中，发现了70个基因，其中A亚型中有54个基因表达上调，B3亚型中有16个基因表达上调（图A）。如预期的那样，基于这些基因集的ssGSEA评分在TCGA- HNSC队列的A亚型和B3亚型、验证型HNSCC队列以及其他肿瘤实体的TCGA队列中得到了显著差异，且在TCGA-HNSC队列中随机森林印迹得到证实（图B）。
STRING数据库进行PPI互作分析显示EGFR、PTGS2是网络中关键的节点（图C）。Pearson相关性分析证实了EGFR转录本与蛋白水平之间呈正相关。与A亚型相比，B3亚型中的EGFR蛋白及磷酸化水平显着更高。此外，Spearman相关分析证实了EGFR或PTGS2转录水平与TCGA-HNSC和大多数验证队列先前研究的22种免疫细胞亚型之间显着负相关（图D）。在GSE117973队列的肿瘤切片IHC染色进一步证实，与A亚型相比，来自B3亚型的肿瘤癌细胞中的EGFR表达更高，而与肿瘤部位无关（图E，F）。
9. EGFR抑制影响与免疫表型相关的DEG的表达
该研究为了证实EGFR信号传导调节A亚型和B3亚型之间的DEGs的表达。该研究分析了GSE45891队列中erlotinib治疗后三种HNSCC细胞系的转录组数据。在3个HNSCC细胞系中，至少有2个细胞系中，厄洛替尼诱导了16个在A亚型中表达较高的DEG表达(EGFR表达较低)，降低了5个在B3亚型中表达较高的DEG表达(EGFR表达较高)。总之，这些数据支持EGFR通过阻止细胞毒性免疫细胞的激活和/或浸润来调节肿瘤免疫微环境的关键作用。
10. 免疫表型相关的DEGs影响ICI治疗反应
该研究为了探索A亚型和B3亚型之间的DEG是否可作为ICI反应的生物标记物。在GSE93157队列中，该研究利用anti-PD1抗体治疗的非小细胞肺癌（NSCLC），HNSCC和黑色素瘤患者的免疫基因检测结果。共200个免疫面板基因表达差异(logFC>0.5, P < 0.05)，且在非进展(CR、PR和SD)中表达显著高于PD。其中有一半在TCGA-HNSC队列A亚型和B3亚型的DEGs中（图A）。通过LASSO回归构建风险模型。四组中，PD的风险评分均显著高于其他各组(图B)。正如预期的那样，风险评分的增加与不良预后相关（图C，D）。
四、优缺点
优点：
1. 对多组学，多数据平台进行了综合分析，以突出肿瘤免疫分类与突变景观或改变的表观遗传模式之间的关联。
2. 发现EGFR是肿瘤免疫微环境的关键调节剂和潜在的药物靶点，可以加速细胞毒性免疫细胞对肿瘤的浸润，提高肿瘤的疗效ICI效果。
3. 基于10个免疫相关候选基因的表达建立回归模型，并证实其预后价值。
缺点：
1. 不能正式排除其他免疫细胞亚型的存在以及它们调节头颈部鳞状细胞癌的肿瘤免疫微环境的特性，但CIBERSORT未进行评估。
2. 在本研究中，在没有进行ICI治疗时，几乎所有接受训练和验证的HNSCC患者都接受了手术、放疗或化疗。如有特定ICI治疗的大样本队列效果更佳。
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